Ионная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией для изучения метаболизма

  • Козин Николай
  • 05 октября 2021
Метаболомика – молодая развивающаяся наука, занимающаяся изучением и анализом метаболома – совокупности всех низкомолекулярных метаболитов клетки. Качественно и количественно определить состав метаболома можно с помощью обращенно-фазовая высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией (МС). Методы обращенно-фазовой ВЭЖХ охватывают широкий спектр соединений. Однако ионные и полярные соединения, такие как органические кислоты, углеводы, нуклеотиды и аминокислоты, трудно удерживаются и разделяются на обращенно-фазовых колонках. Ионообменная хроматография (ИХ) предлагает гораздо лучший способ разделения этих соединений.

 Основная проблема в изучении метаболома - количественная оценка огромного количества мелких частиц, молекулярных компонентов биологических жидкостей и клеток. Кроме того, анализируемые образцы требуют трудоемкой подготовки. Для приемлемой идентификации оценки и количественной оценки компонентов метаболома требуется более одного метода хроматографии. Газовая хроматография в сочетании с МС может использоваться для летучих соединений с высоким разрешением. Жидкостная хроматография открывает более широкий спектр соединений. Ионообменая хроматография позволяет анализировать компоненты, которые не удерживаются на обращенно-фазовых колонках.

Масс-спектрометрия - наиболее предпочтительный метод обнаружения соединений из-за ее исключительной чувствительности, способности разделять совместно элюирующие соединения и дополнительной информации, которую она предоставляет для идентификации соединений. Несмотря на то, что доступны методы подавления элюента, которые эффективно превращают элюент с содержанием ионов гидроксида натрия или калия с высокой проводимостью обратно в чистую воду посредством ионообменного замещения ионами водорода. Ионная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией уже успешно применяется в анализе органических кислот в напитках, сельскохозяйственных химикатах и загрязнителях. Для ионных и полярных соединений, таких как органические кислоты, углеводы, нуклеотиды и аминокислоты, которые трудно разделить на обращенно-фазовых колонках, ионообменная хроматография предпочтительна.

Специалисты Thermo Scientific использовали анионообменная хроматографию в сочетании с МС, газовую обращенную хроматографию и гидрофильную хроматографию для исследования метаболического профиля образцов мочи. Классы соединений, идентифицированные с помощью каждого метода, сравнивались, чтобы оценить преимущества ИХ в исследовании метаболома. Идентификация метаболитов, полученная из данных ЖХ-МС, выполняли только по точной массе с помощью баз данных (XCMS, MZmine, SIEVE ™, MassTRIX и MetExplore). Времена удерживания также могут применяться для повышения достоверности идентификации, но ограничены из-за требований к с доступными стандартам метаболитов. Исследование показало совпадение различных аналитических методов с точки зрения идентифицированных соединений. Вместе с тем, демонстрирует значительное снижение охвата выявленных метаболитов, если какой-либо из трех методов не используется. Ионообменная хроматография позволила увидеть несколько классов соединений, таких как аминокислоты, ароматические кислоты, кетокислоты, карбоновые кислоты, нуклеозиды, пурины, углеводы и глюкурониды, которые являются составной частью нескольких важных биологических путей.

картинка для статьи по ионной хроматографии в изучении метаболома

 Большой охват промежуточных продуктов, участвующих в путях синтеза, приводит к лучшему пониманию механизмов контроля и болезненных состояний. Данные ИХ-МС могут быть чрезвычайно полезны для идентификации и количественной оценки компонентов гликолитических путей. Это ожидаемо для промежуточных продуктов, содержащих карбоновые кислоты и фосфатные группы. Отрицательно заряженные метаболиты хорошо разделяются на ионообменных колонках и уже ионизированы, что облегчает анализ с применением электроспрея (ESI). Аналогичные улучшения были замечены в идентификации путей синтеза аминокислот. С помощью этого комбинированного подхода 379 из 652 промежуточных продуктов были надежно идентифицированы с минимальными усилиями по оптимизации.

Сочетание обращенно-фазовой, гидрофильной и ионообменная хроматографии высокого разрешения обеспечивает превосходную глубину и широту анализа. В новых разработках капиллярных ИС используется технология колонок меньшего размера, что увеличивает чувствительность и позволяет анализировать гораздо меньшие объемы образцов. Масс-спектрометры становятся все более чувствительными, быстрыми и обеспечивают более высокое разрешение для разделения, обнаружения и идентификации в метаболомике.

 

Источник